리셉터-리간드 결합력 평가
[ 주의점, 해결방안 ]
리셉터-리간드 결합력 평가 결과의 정확성을 높일 수 있습니다.
점검항목에는 리셉터의 구조, Time-to-equilibrium, 리셉터와 리간드의 농도가 있습니다.
Time-resolved technique과 살아 있는 세포를 함께 사용하면 장점이 있습니다.
평형상수 (KD) 뿐만 아니라 결합 dynamics 지표인 속도상수 (ka, kd)를 구할 수 있습니다.
속도상수, ka, kd는 약물 효능 개선을 위해 사용합니다.
리셉터-리간드 결합력 (KD) 평가 - 점검항목
리셉터 재조합단백질 생산
세포표면에 존재하는 리셉터는 외부의 신호를 세포내부로 전달하는 역할을 합니다. 리셉터에 결합하는 치료제는 2가지의 중 한가지로 작용합니다. 외부의 신호가 전달되지 못하도록 blocker로써 작동하거나, 인위적인 외부신호 전달을 만드는 stimulator로써 작용합니다. 세포의 기능을 활성화하거나 억제할 수 있는 관문인 리셉터는 중요한 치료제 개발 타겟입니다. 리셉터에 결합하여 외부 신호를 전달하는 리간드에는 hormone, neurotransmitter, growth factor 가 있습니다. 리간드와 결합한 리셉터는 세포내 신호전달 체계를 활성화시켜 세포의 기능을 조절합니다.
리셉터에 결합하는 약물개발의 첫번째 단계는 유전자재조합 기술을 이용하여 재조합단백질 형태로 리셉터를 생산하는 것입니다.
유전자재조합 기술의 발전에도 불구하고 재조합단백질 리셉터를 확보하는 것은 여전히 어려운 과정입니다. 복잡한 생물 시스템에 존재하는 일부 리셉터는 아직도 재조합단백질로 생산하기 어렵고 생산하더라도 생산성이 낮아 다양한 연구를 진행하는데 어려움이 있습니다. 왜냐하면 리셉터는 다양한 도메인과 서브유닛으로 구성되어 있으며 이를 기반으로 3D 구조를 갖고 있기 때문입니다. 생산한 재조합단백질 리셉터가 세포표면에 존재할 때와 같은 구조를 그대로 갖고 있지 않다면 다른 결과가 나올 것입니다. 또한 리셉터는 막단백질이기 때문에 재조합단백질로 발현, 생산하면 aggregation이 생기고 불안정해질 수 있습니다.
재조합단백질 생산 과정에서 post-translational modification (PTM)을 반영하는 것은 어려운 일입니다. PTM은 리셉터의 구조와 기능에 영향을 미치는데 이러한 특성이 반영되지 않는다면 재조합단백질의 구조와 기능은 본래의 리셉터와 다를 수 있습니다.
타겟 리셉터를 재조합단백질 형태로 생산하기 어렵거나 변형된 리셉터를 사용할 경우, 원래의 리간드 또는 치료용 단백질이 어떻게 세포표면 리셉터에 결합하는지 그 특성을 조사하는 것은 어려운 일이 될 것입니다.
Time to equilibrium
지난 수십년 전부터 항체치료제 연구자들은 결합 특이성 (specificity)을 높여 in vivo efficacy를 개선하는 연구를 진행하고 있습니다. 이러한 연구의 결과로 binding affinity가 sub-nanomolar에서 picomolar KD 범위에 있는 항체가 개발되고 있습니다. 이러한 특성을 갖는 항체 후보를 선별하는 과정에서 과거와는 다른 상황을 만나게 되었습니다. Binding affinity가 매우 높기 때문에 분석 과정에서 항체를 낮은 농도로 사용해하기 때문에 결합 시그널이 낮아 이를 분석하는 기기의 민감도는 더욱 높아져야 합니다. 또한, 낮은 항체 농도와 느린 해리속도상수 (dissociation rate constant)로 인해 반응이 평형 (equilibrium)에 도달하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 평형에 도달하기 위한 시간이 길어질수록 항원과 항체의 안정 기간이 문제가 됩니다. 상황에 따라서는 항원과 항체가 갖고 있는 안정성 기간 보다 평형에 도달하기 위한 기간이 더욱 긴 경우가 생길 수 있습니다. 이것은 측정한 KD 값에 오류가 포함되는 원인이 됩니다.
리셉터 농도와 KD의 비율
End-point assay를 사용하는 대표적인 방법에는 ELISA, Flow cytometry가 있습니다. End-point assay 방법은 리셉터와 리간드를 일정시간 반응시킨 후 결합 시그널을 측정합니다. 이때 리셉터의 농도와 KD의 크기를 점검해야 합니다. 리셉터의 총량을 R0라고 하고, R0가 KD 보다 훨씬 큰 경우, 즉 R0 >> KD인 경우 평형에 도달하는데 오랜 시간이 필요합니다. 왜냐하면 리셉터에서 해리된 리간드가 바로 옆에 있는 리셉터에 다시 결합할 확률이 높아져 결합과 해리 평형에 도달하기 어렵기 때문입니다. 항체의 binding affinity가 높을수록 더욱더 낮은 농도의 항체를 사용합니다. 이러한 상황은 리셉터 농도와 KD의 차이가 더욱더 벌어지게 만들어 측정한 KD 값에 오류가 들어가는 원인이 됩니다.
리셉터-리간드 결합력 평가 - 해리과정 모니터링 최대 시간
리셉터-리간드의 반응이 평형 (equilibrium)에 도달할 필요가 없는 time-resolved assay를 사용할 때에도 binding affinity가 높은는 항체의 KD 측정은 어려운 일입니다. 해리속도상수 (dissociation rate constant)가 10^–5 s^−1보다 느린 경우 수시간 동안 해리과정을 관찰해야 합니다. 해리속도상수가 매우 작다는 것은 리셉터에 결합한 리간드가 매우 천천히 해리된다는 것을 의미합니다. 해리속도상수를 계산하기 위해서는 일정정도 리셉터에서 해리되는 최소한의 양이 있어야 합니다. 해리되는 양이 매우 작기 때문에 해리곡선이 아래방향으로 내려가는 정도도 매우 작습니다. 이를 확실히 하기 위해서는 baseline이 매우 안정적이어야 미세하게 변하는 해리곡선으로부터 오류가 없는 해리속도상수를 구할 수 있습니다. 또한 사용하는 장비가 이러한 장시간 모니터링을 지원하는지 확인해야 합니다.
어떻게 해결할 것인가?
Live cell을 이용한 리셉터-리간드 결합력 분석
리셉터가 살아있는 세포표면에 정상적인 구조로 존재하는 상태에서 binding affinity, KD를 측정한다면 항체 후보 선별, 항체 엔지니어링 효과를 분석할 때, 실패 가능성을 낮출 수 있습니다. 왜냐하면 세포표면 수용체를 분리하면 수용체가 정상적인 3D 구조를 유지하지 못하고 기능을 잃을 수 있기 때문입니다.
유전공학 기법으로 발현시킨 재조합 리셉터와 세포표면에 존재하는 리세터를 사용하여 KD를 측정하면 결과가 다르게 나올 수 있습니다. 리셉터의 구조가 다를 수 있기 때문입니다. 이러한 KD 값의 불일치는 세포주 사이에서도 존재합니다. 동일한 리간드-수용체 결합이지만 리셉터가 어떠한 세포주 표면에 발현되어 있는지에 따라 리셉터의 구조가 달라져 리셉터-리간드 결합력 KD에 영향을 줍니다. 살아 있는 세표표면 리셉터를 사용하면 KD-to-response의 관련성을 높여 후보약물의 임상 실패를 줄일 수 있습니다.
Time-resolved technique을 이용한 리셉터-리간드 결합력 측정
Time-resolved technique은 end-point assay technique과 다르게 리셉터-리간드 결합이 완전히 평형(equilibrium)에 도달할 때까지 기다릴 필요가 없습니다. 왜냐하면 time-resolved technique은 리셉터-리간드의 결합이 시간에 따라 어떻게 변화되는지를 관찰하여 이를 반응속도 값으로 표시해주고, 이를 사용하여 binding affinity, KD를 계산하기 때문입니다.
리셉터-리간드 반응이 평형에 도달하는 과정에서 리셉터-리간드의 결합과 해리가 계속 일어납니다. 이러한 결합과 해리를 시간에 따른 변화량인 결합속도상수 (association rate constant, ka)와 해리속도상수 (dissociation rate constant, kd)로 표시할 수 있습니다. 그래서 반응이 완전히 평형에 도달하기 전에 결합속도와 해리속도를 알 수 있고, 이를 이용하여 해리평형상수, KD 값을 계산할 수 있습니다.
KD = [L][R] / [LR] = kd/ka
- KD: dissociation equilibrium constant
- L: ligand concentration
- R: receptor concentration
- ka: association rate constant
- kd: dissociation rate constant
해리평형상수, KD는 해리속도상수를 결합속도상수로 나눈 값과 같고 단위는 몰 (M)이 됩니다. KD 값은 리셉터-리간드가 해리되는 양이 적을수록 작은 값으로 표시됩니다.
리셉터-리간드 결합력 분석 - LigandTracer®
Live cell, 리셉터-리간드 결합력 장시간 관찰
LigandTracer®는 petridish에 세포를 배양하여 세포가 petridish에 있는 상태에서 실험을 진행합니다. Petridish에 항체를 넣어주어 세포표면에 있는 리셉터와 결합하는 과정을 실시간으로 모니터링합니다. 일정 시간 동안 결합과정을 실시간으로 관찰한 후, 항체가 들어가 있는 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어줍니다. 이때 새로운 배지에는 항체가 들어있지 않습니다. 이후 세포표면 리셉터에 결합한 항체가 해리되는 과정을 실시간으로 모니터링합니다. Petridish에 배지를 넣어주기 때문에 세포가 오랫동안 살아 있을 수 있습니다. 그래서 해리과정을 장시간 모니터링할 수 있습니다. 생성된 binding curve를 분석하여 결합속도상수 (association rate constant, ka)와 해리속도상수 (dissociation rate constant, kd), 해리평형상수 (dissociation equilibrium constant, KD)를 구합니다. 이때 binding curve의 정리와 분석과정에는 TraceDrawer®를 사용합니다.
실험 진행과정
Cell 준비
측정 준비
데이타 분석, ka, kd, KD
Live cell과 Time-resolved technique으로 ka, kd, KD를 측정하려면 ?
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참고자료
- Ligand binding affinity package. https://ycluebio.com/ligand-binding-affinity-package/
- LigandTracer Application. https://www.ligandtracer.com/applications/
- Binding affinity KD, 항체치료제 성공의 기초. 링크클릭
- Spiegelberg et al. Eur Biophys. 2021;50(7):979-991. 링크클릭