리셉터-리간드 binding kinetics 활용 방법 – 세포표면

리셉터-리간드 binding kinetics 특성을 세포표면에서 관찰합니다. 

재조합단백질 vs 세포표면 리셉터-리간드 간의 상호작용의 차이를 이해합니다.

세포표면 리셉터-리간드 binding kinetics 분석으로 약물 후보의 효능을 예측합니다.

리셉터-리간드 binding kinetics - 재조합단백질 vs 세포표면

재조합단백질 형태로 EGFR을 생산한 경우, 동일한 구조를 갖는 단백질을 사용하여 리셉터-리간드 binding kinetics (ka, kd)를 분석할 수 있습니다. 균일한 EGF와 EGFR을 사용하기 때문에 EGF와 EGFR의 결합을 1:1 binding model로 분석하면 하나의 binding kinetics 데이터와 binding affinity 데이터를 얻을 수 있습니다.

일반적으로 리셉터-리간드 결합력, KD를 평가할 때 가장 단순한 1:1 binding model을 사용합니다. 1:1 binding model은 monovalent인 리간드 하나가 하나의 특이적 리셉터에 결합하는 것을 의미합니다. 이것은 리간드가 결합하는 리셉터 구조가 모두 동하기 때문에 균질한 결합 이벤트가 발생한다고 가정합니다.

세포는 heterogeneous surface를 갖고 있는 복잡한 생명체 단위입니다. 세포막은 유동성을 갖고 있습니다. 그래서 세포막에 있는 구조물들은 상황에 따라 이동하여 결합하고 서로의 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 복잡한 세포표면 환경에 도달한 리간드가 세포와 결합할 때 재조합단백질 형태로 생산된 리셉터에 homogeneous하게 결합하는 것과는 다르게 하나 이상의 수용체와 heterogeneous하게 결합할 가능성이 있습니다. 이 수용체는 동일한 패밀리에 속한 다른 수용체일 수도 있고, 동일한 수용체인데 구조가 변형된 수용체 일 수도 있습니다.

리셉터-리간드 binding kinetics-homogeneous
리셉터-리간드 binding kinetics-heterogeneous

Saturation binding curve - KD 분석

리간드의 농도를 저농도에서부터 고농도까지 변화시키면서 리셉터에 결합하는 시그널을 측정합니다. 사용한 리간드의 농도는 x 축, 결합한 시그널의 농도는 y 축에 표시하여 리셉터-리간드 saturation binding curve를 만듭니다. non-linear regression 모델을 이용하여 fitting을 진행하고 KD를 계산합니다. KD는 총리셉터 농도의 50%와 결합하는 리간드의 농도를 의미합니다.

수식으로 표현하면 아래와 같습니다.

Fraction bound = [L] / (KD + [L])

Fraction bound: 결합한 리셉터 / 총 리셉터
[L]: 리간드 농도
KD: dissociation equilibrium constant

리셐터-리간드 binding-fraction bound

리셉터-리간드 binding kinetics - 상세 분석

리셉터-리간드 binding kinetics fitting 모델 중 1:1 binding model과 1:2 binding model이 있습니다.
실시간으로 관찰한 결합과 해리의 binding curve를 분석할 때 기본적으로 사용하는 fitting 모델은 1:1 binding model입니다. 하나의 리간드가 하나의 리셉터에 결합한다고 가정하고 사용하는 fitting 모델입니다. 이때 분석결과에서는 ka, kd, KD 값 각 1개씩을 계산해 줍니다. 만약 1:1 binding model로 fitting이 잘 되지 않을 경우 리간드가 원래의 리셉터 뿐만 아니라 다른 리셉터에 결합하는 이벤트가 있을 수 있다는 힌트가 됩니다.

예를 들면 EGF가 EGFR과 결합할 뿐만 아니라 EGFR의 또다른 형태인 EGFR’와도 결합하는 경우가 되겠습니다. 이럴 경우, 1:2 fitting 모델을 사용하여 분석합니다. 분석 결과 값은 EGF-EGFR binding kinetics 특징을 보여주는 ka1, kd1, KD1과 EGF-EGFR’ binding kinetics 값인 ka2, kd2, KD2으로 나오게 됩니다.

리셉터-리간드 binding kinetics - Residual plot을 이용한 분석

세포표면 리셉터와 리간드의 결합이 어떤 특성을 갖고 있는지 시각적으로 확인하는 방법이 있습니다. 이것은 residual plot이라고 합니다. 리셉터-리간드의 결합 커브를 이용해 binding kinetics 파라미터 값을 계산하는 과정을 진행하면 생성되는 plot입니다. Residual plot은 리셉터-리간드 결합에 대한 raw data와 binding kinetics 모델의 fitting data 간의 차이를 표시해주는 그래프입니다. 시각적으로 두 데이터 간의 차이를 확인할 수 있어서 편리합니다. 만약 1:1 binding model로 리셉터-리간드 결합 커브에 대해 fitting을 진행하였는데 raw 데이터와 fitting model 데이타 간의 차이가 생기면 +/- 진폭이 그려집니다. 이러한 차이가 클수록 residual plot의 +/- 진폭은 더욱더 커지게 됩니다. 이러한 상황은 사용한 리셉터-리간드 결합이 1:1 binding model을 따르지 않는다는 것을 의미합니다. 이것은 세포표면 리셉터-리간드 결합이 재조합단백질 수준의 리셉터-리간드 결합과 다른 특성을 갖고 있을 때 나타납니다.

실제 분석상황에서는 기본적으로 1:1 binding model로 데이터를 분석하고, 분석결과를 점검한 후 1:2 binding model을 사용하여 다시 fitting을 진행합니다. 1:1 binding model과 1:2 binding model로 fitting 한 후 나오게 되는 fitting 값의 유의성 지표와 각각의 residual plot을 시각적으로 점검하여 세포표면 리셉터-리간드 결합특성을 분석합니다.

세포표면에서 일어나는 리셉터-리간드 결합 ka, kd, KD를 측정하려면 ?

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참고자료

  1. Ligand binding affinity package. https://ycluebio.com/ligand-binding-affinity-package/
  2. LigandTracer Application. https://www.ligandtracer.com/applications/
  3. Binding affinity KD, 항체치료제 성공의 기초. 링크클릭
  4. Björkelund et al. PLoS One. 2011;6(1):e16536. 링크클릭