약물과 수용체의 Heterogeneous Binding Affinity KD 시각화 방법

약물과 수용체 결합특성 : 세포표면 수용체와 약물의 heterogeneous binding affinity KD를 시각화하는 방법입니다. 

세포표면 수용체는 heterogeneous한 variant form으로 존재합니다 : homo/heterodimer, Post-Translational Modification

Time-resolved analysis 란?

최근 기술과 장비의 발달로 protein-protein interaction의 특성을 조사하는 방법으로 시간에 따라 어떠한 변화가 있는지 모니터링하는 time-resolved analysis를 다양한 연구분야에서 사용하고 있습니다. Time-resolved analysis는 시간에 따른 단백질간의 결합과 해리 과정을 실시간으로 관찰하는 것을 말합니다. 여기에서 사용하는 리셉터는 재조합단백질 형태로 제작하여 사용하고 있습니다. 이것은 살아 있는 세포에서 분리된 상태의 리셉터를 사용하고 있다는 것을 의미합니다.

약물과 수용체 결합분석 모델의 기본 가정과 오류발생 상황

재조합단백질 리셉터-리간드의 binding kinetics, binding affinity를 분석할 때 기본적으로 갖고 있는 가정은 하나의 ligand가 하나의 receptor에 결합하는 one-to-one binding 모델입니다. 즉 homogeneous 결합 모델로 분석합니다. 그러나 세포표면 리셉터-리간드의 결합으로 생성된 binding curve는 재조합단백질 리셉터-리간드의 homogeneous 결합모델로 분석할 경우 오류가 생겨 결과를 해석하기 어려운 상황이 생길 수 있습니다. 세포표면에서 일어나는 리셉터-리간드, 리셉터-약물의 결합은 복잡한 heterogeneous 결합패턴을 보이기 때문입니다.

약물과 수용체 Binding kinetics의 변화: 세포표면 리셉터 vs 재조합단백질 리셉터

재조합단백질 리셉터의 경우 생산에 필요한 조건을 통제하여 항상 일정한 생산 조건에서 생산하기 때문에 구조와 기능이 균질한 상태입니다. 이러한 일정한 구조를 갖고 있는 재조합단백질 리셉터와 리간드의 binding kinetics는 homogeneous binding 모델로 분석할 수 있습니다. 이에 반해 세포표면 리셉터는 세포의 상태에 따라 post-translational modification, active/inactive form 혹은 homo/hetero-dimerization이 일어나 다양한 variant 형태로 존재하고 있습니다. 그렇기 때문에 재조합단백질 리셉터의 구조가 균질한데에 비해 세포표면 리셉터는 비균질한 상태입니다. 리간드가 세포표면에 도달하면 원래의 리셉터와 이로부터 변화가 생긴 variant 리셉터와 결합하게 되어 heterogeneous binding 특성을 갖게 됩니다.

(사례) 2종류의 EGF-EGFR 결합특성 시각화: EGFR monomer vs EGFR homodimer

EGF와 EGFR 간의 상호작용은 EGFR이 monomer 상태일 때와 homodimer 상태일때에 따라 다른 결합특성을 보여줍니다. EGFR monomer (그림의 우측 피크)보다 EGFR-EGFR homodimer (그림의 좌측 피크)에서 약 100배 더 안정적인 결합 (stability, kd)을 보여줍니다. 그래서 EGF가 EGFR-EGFR homodimer에 결합하는 결합력 affinity (KD)는 EGFR monomer에 비해 100배 높은 특성을 갖고 있습니다. 이렇게 특성이 다른 2종류의 결합이 A431 세포 표면에서 동시에 발생할 수 있습니다.

A431 cell에 tyrosine kinase inhibitor를 처리하면 EGF와 EGFR의 heterogeneous binding 패턴이 변하는 것을 관찰할 수 있습니다. Erlotinib을 A431 cell에 처리하면 EGFR의 homodimer 형성이 유도되고 이로 인해 affinity가 다른 2종류의 결합 중, affinity가 높은 결합이 많아져서 결합력이 높은 상태로 이동한 것을 관찰할 수 있습니다. Lapatinib의 경우 A431 cell에 처리하면 EGFR의 homodimer 형성을 억제하는 특성이 있습니다. 결과적으로 affinity가 낮은 결합이 많아지게 되어 EGF의 결합력 (affinity)을 낮은 방향으로 이동시키는 특성을 보여줍니다.

약물과 수용체 - EGF-A431-untreated
약물과 수용체 - EGF-A431-Erlotinib
약물과 수용체 - EGF-A431-Lapatinib

출처: Interaction Map. https://www.ligandtracer.com/product/interaction-map/

시각화 방법: 세포표면에서 일어나는 약물과 수용체 heterogeneous binding 분석

Interaction Map (IM)은 세포표면에서 일어나는 heterogeneous interaction을 분석하기 위해 개발되었습니다. Interaction Map은 time-resolved binding curve에 포함되어 있는 heterogeneous interaction을 분석합니다. 그리고 지도에서 사용하는 좌표처럼 Interaction Map에 2차원 좌표로 위치를 시각적으로 확인할 수 있게 보여줍니다. Heterogeneous interaction을 구성하는 각각의 interaction은 x 축은 ka 값, y 축은 kd 값인 2차원 좌표에 표시됩니다. Interaction Map으로 각각의 interaction이 어떤 특성을 갖고 있는지 한눈에 파악할 수 있습니다.

세포표면에서 일어나는 리셉터-리간드 결합 특성을 시각화 하려면 ?

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참고자료

  1. Ligand binding affinity package. https://ycluebio.com/ligand-binding-affinity-package/
  2. LigandTracer Application. https://www.ligandtracer.com/applications/
  3. Binding affinity KD, 항체치료제 성공의 기초. 링크클릭
  4. Altschuh et al. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(1):74-79. 링크클릭