Binding affinity의 차이 – 세포표면 vs 재조합단백질
Binding affinity의 차이 – 세포표면 리셉터와 재조합단백질 리셉터 간의 affinity 차이를 관찰합니다.
세포표면 리셉터-리간드 binding kinetics 분석으로 약물 후보의 효능을 예측합니다.
세포표면 리셉터 vs 재조합단백질 리셉터 차이점은?
리셉터 - 약물개발 타겟
세포표면 리셉터는 외부의 시그널을 세포내부로 전달해주는 매개체입니다.
세포는 리셉터를 통해 들어오는 시그널에 대해 순응반응을 하거나 거부반응을 합니다.
암세포의 리셉터가 외부 리간드와 결합하여 세포의 증식을 유도하는 시그널을 세포 내부로 전달하는 경우, 그 증식 시그널을 전달하는 리셉터를 타겟으로 약물개발 프로젝트를 진행합니다.
프로젝트를 통해 개발되는 약물의 기능은 리간드의 신호를 전달하는 리셉터에 결합하여 리간드의 신호를 차단하는 것입니다.
신호의 전달은 물질간의 결합으로부터 시작됩니다. 그런면에서 리간드-리셉터, 약물-리셉터의 결합특성을 조사하는 것은 약물개발 프로젝트의 출발이라 할 수 있습니다.
세포표면 리셉터와 binding affinity의 차이
리셉터가 리간드와 혹은 약물과 어떠한 binding affinity (KD)를 갖고 결합하는지, 결합속도 (ka)와 해리속도 (kd)는 어떻게 되는지 조사하기 위한 첫번째 단계는 유전공학기술을 이용하여 재조합단백질의 형태로 타겟 리셉터를 만드는 것입니다.
세포막을 투과하는 리셉터는 세포막 외부 (extracellular), 세포막 부위 (transmembrane), 세포막 내부 (intracellular) 부분으로 이루어져 있습니다.
재조합단백질 형태로 리셉터를 제작할 때는 세포막 외부인 extracellular domain 부분의 DNA 서열을 이용하여 재조합단백질을 HEK293 cell이나 CHO cell에 발현시켜 생산합니다.
그렇기 때문에 재조합단백질 리셉터는 리간드와의 결합 혹은 약물과의 결합특성 분석 용도에 집중되어 있습니다.
만약 리셉터-리간드의 결합, 리셉터-약물의 결합특성이 세포에 어떠한 영향을 미치는지 혹은 세포가 이러한 결합에 어떠한 영향을 주는지를 분석하려면 재조합단백질 리셉터가 아니라 세포표면 리셉터를 사용해야 합니다.
결합 특성 분석
재조합단백질 형태의 리셉터를 확보하게 되면 ELISA, SPR과 같은 다양한 분석법을 이용하여 리셉터-리간드 결합특성을 조사합니다.
리셉터-리간드의 결합유무와 간접적인 결합력은 end-point assay를 사용합니다.
리셉터-리간드의 dynamic binding 특성을 구성하는 결합속도 (ka), 해리속도 (kd) 그리고 결합력 (KD)에 대한 정보는 real-time binding assay를 주로 사용합니다.
재조합단백질을 이용한 실험은 구조가 일정한 리셉터를 대량으로 생산하여 사용하기 때문에 주어진 실험조건에서 항상 일정한 데이터를 반복적으로 보여주는 장점이 있습니다.
이러한 점은 빠른 시간내에 재조합단백질 리셉터와 리간드의 결합특성이 어떠하다는 결론에 도달하고 이를 기반으로 약물이 어떠한 특성을 갖고 있어야 할지 계획할 수 있게 해줍니다.
약물을 개발하는 과정에서는 분석한 리셉터-리간드의 결합특성을 참조하여 약물을 스크리닝하고 후보약물을 선별합니다.
이때 재조합단백질 리셉터는 약물 스크리닝 과정 초기에서부터 종료까지 일정한 리셉터 구조를 사용할 수 있게 해줍니다.
또한 HEK293 혹은 CHO 세포를 이용해 연구에 필요한 양을 생산할 수 있기 때문에 스크리닝 진행에 필요한 충분한 양의 리셉터를 확보할 수 있습니다.
이것은 스크리닝 과정에서 도출된 데이터를 동일한 조건에서 평가하고 이를 기반으로 목표로 하는 결합특성을 갖는 약물 후보를 선별합니다.
선별한 약물은 재조합단백질 수준의 리셉터를 대상으로 결합특성을 조사한 것이기 때문에 세포 수준에서 혹은 동물 수준에서도 동일한 리셉터-리간드, 리셉터-약물 결합특성을 보이는지 확인하는 과정을 거쳐 최종 후보를 선별합니다.
리셉터-리간드의 binding affinity는 동일한가? - 세포표면 vs 재조합단백질
약물을 개발하는 과정에서 재조합단백질 리셉터를 사용하는 것은 여러가지 장점이 있습니다.
리셉터-리간드의 binding affinity와 binding kinetics가 연구자가 설정해 놓은 환경에서 어떻게 되는지 확인할 때 재조합단백질 리셉터를 사용합니다.
이러한 과정에서 확인한 약물의 결합속도 (ka), 해리속도 (kd), 결합력 (KD)을 기초로 약물 후보를 선별하고 약물 최적화 과정을 진행합니다.
분자수준에서 진행하는 재조합단백질 리셉터에 대한 리간드 혹은 약물의 결합특성이 살아 있는 생명체에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위해 세포수준과 동물수준에서 다시 점검을 합니다.
예를 들면 gefitinib은 EGFR의 tyrosine kinase 활성을 억제하여 세포가 성장하지 못하도록 하는 기능을 갖고 있습니다.
그러나 세포를 이용한 실험의 결과는 효과가 일정하게 나오지 않는 것을 관찰할 수 있습니다. 또한 실제 임상에서는 많은 환자가 gefitinib에 반응하지 않고 약물치료 효과가 나타나지 않고 있습니다..
여러가지 원인 중 하나로 생각해 볼 수 있는 것은 gefitinib의 결합으로 EGFR의 구조변화가 일어나고 결과적으로 EGF와 EGFR의 binding affinity와 binding kinetics에 변화가 생기는 것입니다.
이러한 상황은 재조합단백질 리셉터로는 확인할 수 없는 것입니다.
재조합단백질 리셉터는 일반적으로 세포막 외부부위인 extracellular domain만으로 이루어져 있고, tyrosine kinase가 있는 세포 내부부위는 갖고 있지 않아 gefitinib이 tyrosine kinase에 결합하여 생기는 효과를 관찰할 수 없습니다.
재조합단백질 리셉터 수준의 결합특성이 세포단계 그리고 임상단계에서는 다양한 이유로 인해 다를 수 있습니다.
재조합단백질 리셉터와 정의된 환경에서 확인한 리셉터-리간드 결합특성이 살아 있는 세포표면에서 변할 수 있는지 확인해 보는 것은 단백질 수준에서 정의한 결합특성을 보완하여 약물의 임상적 효능을 보다 정밀하게 예측하는 방법입니다.
리셉터-리간드의 binding affinity는 동일한가? – Starvation stress의 영향
Hypoxia, starvation은 tumor cell의 미세환경을 특징짓는 대표적인 상황입니다.
세포가 살아남기 위해는 에너지와 영양분을 필요로 하기 때문에 hypoxia와 starvation은 살아 있는 세포의 생존을 위협하는 스트레스가 될 수 있습니다.
Tumor cell은 성장하는 속도가 일반 정상세포보다 빠르기 때문에 성장에 맞추어 tumor cell 주변에 혈관이 생성되기 전에 tumor cell 군집을 키우는 특징이 있습니다.
이러한 결과로 혈관을 통해 충분한 산소와 영양분을 제공받지 못하기 때문에 에너지와 영양분에 대한 스트레스 환경을 갖게 되고 여기에 적응하여 살아남는 생존능력을 갖고 있습니다.
이와는 다르게 재조합단백질 리셉터의 경우 생명체가 아니기 때문에 hypoxia, starvation 환경으로부터 스트레스를 받지 않습니다.
재조단백질은 호흡을 하기 위한 산소가 필요하거나 생명을 유지하기 위한 영양분이 필요하지 않습니다.
실제 임상적 상황과 유사한 환경을 만들어 starvation 스트레스와 이로인한 리셉터-리간드 결합의 특성을 연구하기 위해서는 살아 있는 세포를 사용해야만 의미 있는 결과를 얻을 수 있고 재조합단백질 리셉터로는 결과를 얻을 수 없습니다.
리셉터-리간드의 binding affinity는 동일한가? – 약물 (예: Gefitinib) 결합의 영향
Gefitinib은 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer) EGF 리셉터의 tyrosine kinase에 결합하여 downstream signal을 억제하기 위해 개발된 TKI (tyrosine kinase inhibitor)입니다.
EGFR은 세포막 외부부분과 세포막 내부부분으로 나누어집니다. Tyrosine kinase는 세포막 안쪽에 위치하고 있는데 이 위치에 gefitinib이 결합합니다. 문헌에 의하면 gefitinib을 A431, U343에 처리하면 처리하지 않았을 때에 비해 EGF의 uptake가 증가하는 것으로 알려져 있습니다.
Gefitinib이 EGF 리셉터의 세포막 안쪽 도메인에 결합하여 세포막 외부의 도메인 구조를 변화시키고 이에 따라 EGF-EGFR binding affinity의 차이, 결합 특성 변화가 있을 수 있습니다.
외부자극에 대한 생명체의 반응으로 외부자극이 있기 이전에 생명체가 본래 갖고 있던 리셉터-리간드의 결합특성이 변할 수 있다는 것은 흥미로운 일입니다. 재조합단백질 리셉터의 경우, 특히 세포막 외부부분만 생산하여 사용하기 때문에 세포막 안쪽 도메인의 자극으로 인한 세포막 외부 도멘인의 구조적 변화와 이로 인한 리셉터-리간드 결합특성 변화를 조사할 수 없습니다.
재조합단백질 리셉터를 이용해 확인한 결합속도 (ka), 해리속도 (kd), 결합력 (KD)이 세포수준에서도 동일한지, 상황에 따라 변하는지, 변한다면 어떠한 특성으로 변하는지 확인하기 위해서는 살아 있는 세포를 사용해야 합니다.
리셉터-리간드의 binding affinity는 동일한가? - 세포 종류의 영향
재조합단백질 리셉터 상태에서 확인한 결합속도 (ka), 해리속도 (kd), 결합력 (KD)은 정해진 조건에서 실험을 진행할 경우 반복적으로 동일한 결과가 나옵니다.
동일한 구조의 재조합단백질 리셉터와 여기에 결합하는 리간드 혹은 약물을 일정한 조건에서 재조합단백질 리셉터와 반응시키기 때문입니다.
재조합단백질을 사용하여 얻은 결합특성 값이 일정하기 때문에 이를 그대로 세포 수준에 적용할 수 있다고 생각할 수도 있습니다.
그러나 세포표면은 하나의 단백질로만 이루어진 단순한 구조가 아니라 유사한 혹은 변형된 구조의 단백질이 산재해 있는 복잡한 구조를 갖고 있습니다.
이러한 환경 속에 있는 세포표면 리셉터는 재조합단백질 리셉터-리간드의 단순한 결합환경과는 다른 결합특성을 보일 수 있습니다.
각각의 세포는 자신이 존재하는 환경에 반응하여 각자의 독특한 세포표면 환경을 갖고 있습니다.
이러한 결과로 세포의 종류에 따라 리셉터의 발현양, 발현하고 있는 리셉터의 종류, 그리고 발현한 리셉터들의 homodimer, heterodimer 형성 패턴이 다를 수 있습니다.
예를 들면, A431과 U343 세포의 경우 EGFR이 과발현 되어있고 HER2의 발현은 낮은 세포표면을 갖고 있습니다. 이와는 다르게 SKOV3와 SKBR3는 HER2가 EGFR 보다 더 과발현되어 있습니다.
세포의 종류에 따라 달라지는 이러한 세포표면의 다양성으로 인해, 동일한 리셉터라고 하더라고 위치한 곳의 환경, 구조, dimerization 정도가 달라 binding affinity의 차이 혹은 변화가 있을 수 있습니다.
예를 들면, 재조합단백질 EGFR은 동일한 구조를 갖고 있지만 세포표면의 EGFR은 갖고 있는 주변의 환경이 다를 수 있고, EGFR-EGFR, EGFR-HER2와 같이 dimerization의 종류, 비율이 다를 수 있습니다.
EGF가 여러 세포에 각각 어떠한 결합력 (KD)으로 결합하는지를 조사하면 각기 다른 결합력 (KD)를 보인다는 것으로 보아 세포표면의 다양성이 리간드 혹은 약물의 결합력에 영향을 준다고 할 수 있습니다.
세포표면에서 일어나는 리셉터-리간드 결합 ka, kd, KD를 측정하려면 ?
보다 자세한 내용은 문의하기를 클릭하세요.
참고자료
- Ligand binding affinity package. https://ycluebio.com/ligand-binding-affinity-package/
- LigandTracer Application. https://www.ligandtracer.com/applications/
- Binding affinity KD, 항체치료제 성공의 기초. 링크클릭
- Björkelund et al. PLoS One. 2011;6(1):e16536. 링크클릭