ELISA Binding Affinity
KD 값 계산 방법

항체치료제 ELISA binding affinity  KD 값 계산 방법에 대해 알아보겠습니다.

Binding affinity KD 는 약물의 효능, 특이성, 안정성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 

Binding Affinity, KD 의미는?

KD는 분자간 상호작용 연구에서 중요한 파라미터로, 표적 단백질의 총 결합 부위 중 50%의 결합 부위와 결합하기 위해 필요한 리간드 농도를 의미합니다. 예를 들어, 표적 단백질의 총 결합 부위가 100개인 경우 이중 50개의 결합 부위와 결합하기 위해 필요한 리간드 농도를 KD 라고 합니다. KD 값이 낮을수록 낮은 리간드 농도로 타겟의 50%와 결합할 정도로 결합 강도가 강하다는 것을 의미합니다. 이러한 상호작용 강도를 정량화할 때 ELISA saturation binding assay를 사용하여 KD를 분석합니다.

ELISA Saturation Binding Assay 란?

ELISA saturation binding assay는 리간드와 리셉터의 binding affinity, KD를 측정하기 위해 사용하는 실험 방법입니다. 예를 들어, 항체치료제와 리셉터 사이의 해리평형상수, KD를 분석할 때 사용합니다. 리간드 농도 증가량에 따라 리간드와 결합한 리셉터의 개수가 증가합니다. 이러한 각 리간드 농도 별 결합증가는 발색 혹은 형광 시그널이 증가하는 것으로 알 수 있습니다. 리간드 결합 시그널의 최대 크기는 리셉터의 최대 개수에 따라 달라집니다. 그래서 어떤 특정 리간드 농도에서 부터 리간드 농도를 더 올려도 시그널이 증가하지 않게 됩니다. 이러한 상태를 리셉터 포화 (receptor saturation) 상채라고 합니다. 포화상태에서는 모든 리셉터가 리간드와 결합해, 남아 있는 자유 리셉터가 없는 상태입니다.

KD 값 계산 과정

ELISA 실험 진행과정

일반적인 ELISA 실험 방법을 따라 saturation binding assay를 진행합니다.


1) Initial screening
KD의 0.1, 1, 10, 100 배 농도의 receptor를 코팅합니다. 예비 saturation binding assay를 진행하여 낮은 binding signal 부터 saturation binding 시그널까지 커버할 수 있는 농도를 선택합니다.


2) Coating
Initial screening에서 정한 농도로 리셉터를 코팅합니다.


3) Blocking


4) Ligand solution 준비

Ligand의 농도는 예측하는 KD를 기준으로 높은 농도와 낮은 농도를 serial dilution 하여 준비합니다. 예를 들어, KD가 10 nM로 예측된다면, ligand는 1 nM ~ 100 nM 범위로 준비합니다. 리간드의 농도범위가 넓을수록 KD의 정확도가 높아집니다.


5) Ligand binding
6) Washing and detection
7) Signal measurement


8) Data analysis
실험에 사용한 일련의 리간드 농도를 x 축에, 각 리간드 농도에서의 결합 시그널을 Y 축에 넣어 saturation binding curve를 그립니다.

Binding affinity, KD 값 계산 하기

실험에서 얻은 saturation binding curve를 이용하여 KD를 계산해 보겠습니다. 분석은 one-site binding model을 이용합니다. One-site binding model은 리간드가 결합하는 리셉터의 부위가 1개로 가정하는 모델입니다. 

수식은 아래와 같습니다.

 

Y = Bmax * ([L] / (KD + [L]))

 

Y: 결합한 리간드 값
Bmax: 리간드가 결합할 수 있는 최대값
L: 순차 희석한 리간드 농도
KD: 해리평형상수 (dissociation equilibrium constant)

 

KD는 총 receptor binding site 중 50%의 binding site에 결합하기 위한 리간드의 농도입니다. KD 값이 작을수록 리셉터와 리간드가 더욱 강하게 결합하는 것을 의미합니다.
예를 들어, (a) 리간드의 KD가 1 x 10^-9 M이고 (b) 리간드의 KD가 1 x 10^-10 M 일 경우, (b) 리간드의 KD 값이 더 작아서 결합체가 해리되는 정도가 더 낮고 그래서 binding affinity는 더욱 강하다고 해석합니다.

Binding affinity, KD 값 계산

진행한 실험 데이터를 엑셀에 아래와 같이 정리합니다.
Ligand [nM]       Bound [OD]
0.125                  0.12
0.25                    0.27
0.5                      0.5
1                         0.96
2                         1.42
4                         1.85

X 축은 Ligand [nM], Y 축은 Bound [OD] 값을 이용하여 그래프를 그립니다.

 

KD 값 계산 - ELISA binding affinity

Y = ( Bmax * [L] ) / (KD + [L]) 수식의 Bmax와 KD를 증감시켜 생성되는 그래프를 위의 그래프와 오버랩 시키는 fitting 과정을 반복합니다. 두 그래프의 차이가 가장 작을 때 사용한 KD가 saturation binding assay에서 사용한 리셉터와 리간드의 binding affinity, KD가 됩니다.

KD 값 계산 - ELISA binding affinity KD fitting

어떤 방법으로 Cell Binding affinity KD를 측정할까?

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참고자료

  1. Ligand binding affinity package. https://ycluebio.com/ligand-binding-affinity-package/
  2. LigandTracer Application. https://www.ligandtracer.com/applications/
  3. Binding affinity KD, 항체치료제 성공의 기초. 링크 클릭하기